FISH技術(shù)：熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)

　　1974年Evans將染色體顯帶技術(shù)和染色體原位雜交聯(lián)合應(yīng)用，提高了定位的準(zhǔn)確性。20世紀(jì)70年代后期人們開始探討熒光標(biāo)記的原位雜交，即FISH技術(shù)。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標(biāo)本上，標(biāo)志著染色體定位技術(shù)取得了重要進(jìn)展。20世紀(jì)90年代，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)行，由于繪制高分辨人類基因組圖譜的需要，F(xiàn)ISH技術(shù)得到了迅速的發(fā)展和廣泛應(yīng)用。

　　1．原理

　　將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、地高辛，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對(duì)待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。

  

肺腫瘤細(xì)胞FISH

　　2．實(shí)驗(yàn)流程

　　FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→染色體顯帶→熒光顯微鏡檢測→結(jié)果分析。

　　3．特點(diǎn)

　　原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢在于對(duì)制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定、自顯影時(shí)間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

　　缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

　　4．應(yīng)用

　　該技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢。

根生實(shí)驗(yàn)流程

一、探針及標(biāo)本的變性
（1）探針變性：將探針在75℃怛溫水浴中溫育5min，立即置0℃，5～10min，使雙鏈DNA探針變性。

（2）標(biāo)本變性：

①將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50℃培養(yǎng)箱中烤片2～3h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。

②取出玻片標(biāo)本，將其浸在70～75℃的體積分?jǐn)?shù)70%甲酰胺/2×SSC的變性液中變性2～3min。
③立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%、體積分?jǐn)?shù)90%和體積分?jǐn)?shù)100%冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。
二、雜交:
將已變性或預(yù)退火的DNA探針10mL滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上18×18蓋玻片，用Parafilm封片，置于源潮濕暗盒中37℃要交過夜（約15～17h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。
三、洗脫：此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。
（1）雜交次日，將標(biāo)本從37℃溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。
（2）將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱42～50℃的體積分?jǐn)?shù)50%甲酰胺/2×SSC中洗滌3次，每次5min。
（3）在已預(yù)熱42～50℃的1×SSC中洗滌3次，每次5min。
（4）在室溫下，將玻片標(biāo)本2×SSC中輕洗一下。
四、雜交信號(hào)的放大:
（1）在玻片的雜交部位加150mL封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37℃溫育20min。
（2）去掉保鮮膜，再加150mL avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋，37℃繼續(xù)溫育40min。
（3）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的洗脫液中洗滌3次，每次5min。
（4）在玻片標(biāo)本的雜交部位加150mL封閉液II，覆蓋保鮮膜，37℃溫育20min。
（5）去掉保鮮膜，加150mL antiavidin于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37℃溫育40min。
（6）取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱42～50℃的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。
（7）重復(fù)步驟（1）、（2）、（3），再于2×SSC中室溫清洗一下。
（8）取出玻片，自然干燥。
（9）取200mL PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。
五、封片:
    可采用不同類型的封片液。如果封片中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。
六、熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果:
先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針的探針?biāo)谖恢冒l(fā)出綠色熒光。由于本實(shí)驗(yàn)使用的是Y染色體上的特異序列，因此在男性外周血染色體標(biāo)本的雜交中呈陽性，即使在末分裂的細(xì)胞中，也可以觀察到明顯的雜交信號(hào)。照相記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果