zui大速度方法

（1）移動界面超速離心法

含幾個(gè)組分的樣品在足夠高的離心場中離心時(shí)，每種顆粒都達(dá)到其zui大沉降速度，這時(shí)樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，并形成對應(yīng)于樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動相對于每種組分來說是特征的。

雖然利用這種方法不一定能實(shí)現(xiàn)組分的純化分離，但可以通過監(jiān)測界面的移動來測定各組分的沉降速度。要想實(shí)現(xiàn)組分間的分離，必須在所需樣品沉降之后停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，并以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經(jīng)過反復(fù)多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法，它對細(xì)胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉(zhuǎn)速的方法實(shí)現(xiàn)不同組分間的分離，如圖1。

圖1 細(xì)胞勻漿差示分離的示意圖

（a）細(xì)胞勻漿；（b）細(xì)胞碎片；（c）線粒體、過氧化物酶體、溶酶體；（d）微粒體、核糖體；（e）細(xì)胞液；（可溶性蛋白質(zhì)及小分子生物）

（2）移動區(qū)帶超速離心法

差示離心法離心前各組分均勻分布在整個(gè)溶液中，所以分離一般不理想，而移動區(qū)帶超速離心法是一種密度梯度（Dens 心Gradient）離心技術(shù)，在離心之前離心管 中溶液的密度不同（從上到下密度增大），梯度介質(zhì)中zui大密度應(yīng)小于樣品物質(zhì)的zui小密度，其特點(diǎn)是物質(zhì)的分離取決于樣品物質(zhì)顆粒的質(zhì)量．即樣品物質(zhì)的沉降系數(shù)，而不是取決于樣品物質(zhì)的密度，因而適合于分離密度相近而大小和形狀不同的物質(zhì)，這屬于一種非平衡態(tài)分離法。當(dāng)樣品物質(zhì)輕輕地鋪在密度梯度介質(zhì)的液面上，起動離心機(jī) ，在離心力的作用下，一定時(shí)間后便形成不同物質(zhì)的區(qū)帶。當(dāng)繼續(xù)離心時(shí)每個(gè)區(qū)帶會逐一達(dá)到管底，所以，在沉降zui快的區(qū)帶到達(dá)管底之前要停止離心，并將每個(gè)區(qū)帶分部收集。zui常用的制備密度梯度的化合物有蔗糖、氯化銫和硫酸銫等。

等密度方法

等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質(zhì)的密度相等，實(shí)際上是在梯度密度介質(zhì)中進(jìn)行的。該技術(shù)的特點(diǎn)是沉降分離與樣品物質(zhì)的大小和形狀無關(guān)，而取決于樣品物質(zhì)的密度。這種方法非常類似于電泳中的PH 梯度等電聚焦方法，在離心時(shí)，顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移動到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止，其結(jié)果是依樣品物質(zhì)密度的不同在梯度溶劑中形成一個(gè)個(gè)區(qū)帶。

在實(shí)驗(yàn)方法上可以采用預(yù)先制備密度梯度溶液的方法，一般先制備兩種儲備液，它們的濃度決定zui終所形成梯度溶液的極限?？梢酝ㄟ^分步減小密度，從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續(xù)梯度溶液，也可以通過一個(gè)梯度混合器產(chǎn)生連續(xù)梯度密度。儲備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來制備。樣品一般鋪在溶液的表面，然后開始離心。

在實(shí)驗(yàn)方法上也可以采用平衡密度梯度法，在這種離心法中，介質(zhì)的梯度不是預(yù)先配制，而是在離心過程中，由于離心力的作用而逐漸形成。樣品物質(zhì)和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻，離心開始之后，銫鹽由于離心力的作用，自離心管口至離心管底形成連續(xù)遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質(zhì)在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區(qū)帶，不同的物質(zhì)zui終到達(dá)相應(yīng)的區(qū)帶，從而實(shí)現(xiàn)分離。這種方法依賴于在離心場的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成，一般需要長時(shí)間的離心（2~3天）。顯然，樣品物質(zhì)的密度應(yīng)介于介質(zhì)梯度中zui大和zui小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。

無論是采用哪種操作方式，zui終都要分別收集處在每一區(qū)帶的樣品組分，一般可采用下述兩種方法實(shí)現(xiàn)：

（1）穿刺法

這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內(nèi)，不同區(qū)帶內(nèi)的組分自下而上地先后從針管內(nèi)分別流出，然后用部分收集器分別收集。

（2）取代法

在離心管口加一個(gè)帶有收集導(dǎo)管的塞子，塞子上同時(shí)裝有一根輸液導(dǎo)管插入離心管的管底，從輸液管中注入高密度的離心介質(zhì)．其密度高于離心管中所形成的zui大密度。當(dāng)取代液不斷注入時(shí)離心管中的溶液逐漸上升，并不斷從收集導(dǎo)管中流出，然后用部分收集器分別收集。